-Protocol-

免疫蛍光染色法

《一般的注意》
＊生材料およびパラフィン材料の水和以降は、全ての反応過程で、切片を乾燥させては絶対にいけない。
＊最初は、内因性（なければ別の）の陽性コントロールと陰性コントロール（１次抗体を抜いたもの）を必ず作ること。
＊下記の方法は一般的なもので、各条件は抗体により、微妙に異なる。
＊最近ではより高感度な変法が多数ある。
＊間接法による２重染色するときの抗体選択の注意：
　　１）染色部位が同じ場合（どちらも核、あるいはどちらも細胞質など）は、２重染色する１次抗
　　　 体を作成している動物が異なること。
　　２）それぞれの２次抗体を作成している動物が、１次抗体を作成している動物と異なること。
　　３）２次抗体をラベルしている蛍光色素を異なったものにすること。
　　　　以上の３つを共に満たしていることが必要。

《染色手順》
１．切片作成まで
　　＜生標本の場合＞
　　　　a)ティッシュテックに包埋した材料を、クリオスタットで薄切する。
　　　　　　培養細胞の場合はそのまま固定する。
　　　　b)固定する。固定液は抗体によって異なる。
　　　　　　通常は、4%PFA, Methanol, Ethanolなどが一般的。

　　＜パラフィン標本の場合＞
　　　　a) 湯のばし法（45度以下）で、パラフィン切片をコーテングスライド上にのせる。
　　　　b) 十分に乾燥。
　　　　c) 脱パラフィン；キシレンの1~4槽、15分ずつ
　　　　d) エタノールアルコール；1~4槽、5分ずつ
　　　　　（最終槽は、奇麗なアルコールを用いる）
　　　　e) DulbeccoのPBSに5分間入れ、水和する。





２．前処理
　　＜賦活処理＞
　　　＊酵素を用いる方法：
　　　　　0.05% Ptoteinase K、0.1%ペプシン（0.5M酢酸）、0.4%ペプシン（0.01N HCl）、1%トリ
　　　　　プシン(PBS)　又はHyaluronidase 25mg/ml PBSなどを数滴滴下し、温室にて20〜60
　　　　　分間反応させる。

　　　＊   マイクロウエーブを使う方法：
　　　　　１） 500ｍLガラスビーカーにスライドと10ｍM クエン酸バッファ（pH6.0）を入れ、アル
　　　　　　　　ミホイルでふたをし、”調理（電子レンジ強）”で 沸騰するまで加熱する。
　　　　　２） 沸騰後、更に加熱し５分間沸騰させる。
　　　　　３）１時間ほどかけて徐冷する。※急冷しないこと。

　　　＊オートクレーブを用いる方法：
　　　　　500ｍLガラスビーカーにスライドと10ｍM クエン酸バッファ（pH6.0）を入れ、アルミホ
　　　　　 イルでふたをし、加熱条件を120℃、10分間とする。

　　＜非特異的反応のブロック＞
　　　　余分のPBSを拭って、5%BSA(Bovine serum albmin)加PBSにて処理。
　　　　（室温、1時間）
　　　　本来は、2次抗体に用いる動物の血清を加えたものを使用

　　＜内因性ペルオキシダーゼやビオチンのブロック＞
　　　＊標識タイラマイドを使う場合や豊富なビオチンを含む組織以外では、内因性ペルオキ
　　　　　シダーゼやビオチンのブロックは必要ない。
　　　　　　上記の場合は、ブロックする。
　　　　内因性ペルオキシダーゼのブロック
　　　　0.3%H2O2加メタノール（100%）　1時間（30分でも可）
　　　　（市販の過酸化水素水（30%）をMethanolで100倍に）
　　　　　　　　　　内因性ビオチンのブロック　　　　　　　
　　　　アビジン・ビオチン溶液で、ブロック処理をする。





３．１次抗体および２次抗体の反応と洗浄
　　　　　a)  5%BSA加PBSを洗わずに拭って、1次抗体を盛る。（100μlずつ）
　　　　　　　1次抗体は、5%BSA加PBSで薄める。
　　　　　　　希釈濃度は、濃度は1次抗体の種類によって異なる。
　　　　　b) 室温で２−３時間反応。あるいは、４℃で一晩反応させる。
　　　　　c) 抗体溶液をPBSで洗い流した後、PBSで5分ずつ、4回洗う。
　　　　　　（ユプリンジャーにつければよい。）
　　　　　d) 蛍光色素かビオチンがラベルされた2次抗体（5%BSA加PBSで100-200倍に希釈）
　　　　　　　 を室温で1時間反応。
　　　　　e) PBSで洗う。（10分×4回）
　　　　　f) ビオチンがラベルされた2次抗体を使った場合は、蛍光色素標識ストレプトアビジン
　　　　　　（5%BSA加PBSで100-200倍に希釈）を室温で1時間反応させる。
　　　　　g) PBSで洗う。（10分×4回）
　　＊２重染色する場合は、両方の１次抗体を混合して、反応させる。２次抗体も混合して、反
　　　 応させる。（参照：間接法による２重染色するときの抗体選択の注意（上記）



４．後染と封入
　　　　a) 後染色
　　　　　　DNA蛍光核染色（PI, DAPI, Hoなど。別記）
　　　　b) 脱水、透徹、封入。
　　＊蛍光の場合は、減衰防止剤を入れること。（別記）