-Protocol-

Fluorescence in situ hybridization for metaphase sample

A．前処理
　　A-1）染色体展開標本の場合
　　　　❶ 0.1% NP-40／2×SSC に浸透（37°C，30 分）する．
　　　　❷ 70%，85%，100% のエタノールで脱水（室温，各1 分）後，風乾する．
　　　　❸変性液70% ホルムアミド／2×SSC に浸透（73°C，5 分）する．
　　　　❹ 70%，85%，100% のエタノールで脱水（室温，各1 分）後，風乾する．
　　　　❺ 45°C のホットプレート上でプレパラートを加熱する．
　　A-2）細胞塗沫標本の場合
　　　　❶ 2×SSC に浸透（72°C，2 分）する．
　　　　❷ 0.05% ペプシンにて酵素処理（37°C，15 分）する．
　　　　❸ 2 × SSC に浸透（室温5 分）する．
　　　　❹ 70%，85%，100% のエタノールで脱水（室温，1 分）後，風乾する．
　　　　❺変性液70% ホルムアミド／2 × SSC に浸透（73°C，5 分）する．
　　　　❻ 70%，85%，100% のエタノールで脱水（室温，1 分）後，風乾する．
　　　　❼ 45°C のホットプレート上でプレパラートを加熱する．

B．ハイブリダイゼーション
　　❶ハイブリダイゼーション液を加熱（75°C，5 分）し，プローブDNA を単鎖化
　　　 する．
　　❷ハイブリダイゼーション溶液を載せる（直径15 mm のカバーガラスの場合5 μ
　　　　l）．
　　❸カバーガラスをかけ，周囲をペーパーボンドで封をする．
　　❹遮光した湿潤箱に入れ反応（37°C，12 時間以上）させる．

C．洗浄
　　❶ペーバーボンドとカバーガラスを剥がす．
　　　（カバーガラスは0.1% NP-40／2×SSC に室温で5 分間浸すと剥がしやすい）
　　❷ 0.3% NP-40/0.4×SSC で洗浄（73°C，2 分）する．
　　❸ 2×SSC で洗浄（室温，5 分）する．

D．対比染色・封入
　　❶ DAPI（100 ng/ml）等のDNA 染色蛍光色素と蛍光褪色防止剤が含まれた封
　　　　入剤で封入する．
　　❷透明なマニキュアで周囲を塗り封をする．